การปฏิสนธินอกร่างกาย

องค์ความรู้เรื่องเทคโนโลยีชีวภาพ - การปฏิสนฺธินอกร่างกาย

การปฏิสนธินอกร่างกาย  (In Vitro Fertilization : IVF)

 

               ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การปฏิสนธิในธรรมชาติระหว่างเซลล์สืบพันธุ์เพศเมีย ที่เรียกว่า เซลล์ไข่หรือ โอโอไซต์ (oocyte) และเซลล์สืบพันธุ์เพศผู้ ที่เรียกว่า เซลล์อสุจิหรือตัวอสุจิ (spermatozoa) จะเกิดภายในทางเดินระบบสืบพันธุ์เพศเมีย (reprocuctive tract) โดยตำแหน่งของการปฏินสธิจะอยู่ภายในท่อนำไข่ ช่วงเวลาที่เรียกว่าเกิดการปฏิสนธิขึ้น หมายถึง เวลาที่ตัวอสุจิเข้าไปในเซลล์ไข่ได้แล้ว ซึ่งนิวเคลียสของอสุจิจะเกิดการ เปลี่ยนแปลงเป็นโปรนิวเคลียส ขณะเดียวกันนิวเคลียสของไข่ซึ่งเป็นส่วนที่เหลือจากการขับ second polar body ออกจาก cytolpasm ก็จะเกิดการเปลี่ยนแปลงเป็นโปรนิวเคลียส จากนั้นจะเกิดการรวมตัวกันของโปรนิวเคลียสทั้งสอง (fusion) เป็นนิวเคลียสเดียว จากนั้นกระบวนการแบ่งตัวหรือแบ่งเซลล์จึงเริ่มขึ้น (รูปที่ 1) ส่วนการปฏิสนธินอกร่างกาย เป็นการนำเซลล์ไข่มาปฏิสนธิกับเซลล์อสุจิในหลอดทดลอง โดยมีการเตรียมความพร้อมของทั้งเซลล์ไข่และเซลล์อสุจิรวมถึงการปรับสภาพแวดล้อมที่เลียนแบบกับที่เกิดในธรรมชาติ เพื่อให้เกิดการปฏิสนธิขึ้นได้และพัฒนาเป็นตัวอ่อนต่อไป

กระบวนการปฏิสนธิ

 

               การปฏิสนธินอกร่างกายในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม มีรายงานความสำเร็จที่ให้ผลการตั้งท้องเป็นครั้งแรกในกระต่าย โดย Chang ในปี ค.ศ.1959 ต่อมามีรายงานความสำเร็จในหนูเมาท์และหนูแรท (อ้างถึงโดย Gordon,1994) สำหรับในโคมีรายงานความสำเร็จได้ลูกเกิดครั้งแรกในปี ค.ศ.1982 (Brackett et al.,1982) โดยการใช้เซลล์ไข่ที่เจริญถึงขั้นปฏิสนธิในร่างกายของแม่โคนำมาผสมกันกับตัวอสุจิในหลอดทดลอง ต่อมาในปี ค.ศ.1988 มีรายงานลูกโคเกิดจากกระบวนการปฏิสนธิภายนอกร่างกายทั้งหมดเป็นครั้งแรก (Goto et al.,1988) นอกจากนี้ยังมีรายงานความสำเร็จในการใช้เทคนิคการปฏิสนธินอกร่างกายของสัตว์อื่น ๆ อีกหลายชนิด ในที่นี้จะเน้นการปฏิสนธินอกร่างกายในโคซึ่งมีการศึกษากันมากที่สุด

 

การใช้เทคนิคการปฏิสนธินอกร่างกายร่วมกับการเก็บเซลล์ไข่ผ่านทางผนังช่องคลอด

               ปัจจุบันเทคโนโลยีการผลิตลูกโคจากการปฏิสนธินอกรางกาย ได้มีการพัฒนาไปอย่างมาก การเก็บเซลล์ไข่เพื่อนำมาปฏิสนธิกับเซลล์อสุจิในหลอดทดลอง โดยการเจาะผ่านทางช่องคลอดร่วมกับการใช้เครื่องอัลตราซาวด์ (ultrasound-guided tranvaginal ovum pick-up : OPU) ได้เริ่มดำเนินการในสัตว์เพื่อลดการบาดเจ็บและอันตรายสำหรับสัตว์ อีกทั้งยังทำซ้ำได้หลายครั้ง (Pieterse et al.,1988) หลังจากนั้นก็มีการพัฒนาการเก็บร่วมกับการผลิตตัวอ่อนโดยการปฏิสนธินอกร่างกาย (Looney et al.,1994; Boni et al.,1996; Reis et al.,2002) และได้นำมาประยุกต์ใช้ในโคพื้นเมืองประจำถิ่น (Bos indicus) แต่ไม่ได้รายงานการผลิตตัวอ่อนถึงระยะที่นำไปย้ายฝากได้ (Manik et al.,2003) ในประเทศไทยมีการศึกษาไม่มากนักเกี่ยวกับการผลิตตัวอ่อนโดยใช้เซลล์ไข่ที่เก็บจากโคขณะมีชีวิตและการปฏิสนธินอกร่างกาย (Techakumphu et al.,1996) แต่มีรายงานในกระบือ (Kittiyanant et al.,1995; Pavasuthipaisit et al.,1995)

               การเก็บเซลล์ไข่โดยใช้เครื่องอัลตราซาวด์ มีข้อด้อย ได้แก่ เครื่องมือมีราคาแพง ประกอบด้วยอุปกรณ์หลายชิ้น ทำให้ใช้งานไม่สะดวก นอกจากนี้หัวโพรบยังมีขนาดใหญ่ ไม่สามารถใช้กับโคประจำถิ่น เช่น พันธุ์พื้นเมืองภาคใต้ของไทย โคขาวลำพูน ซึ่งมักมีขนาดเล็กกว่าพันธุ์นมและพันธุ์เนื้อจากต่างประเทศ อนุชา และคณะ (2545) ได้รายงานความสำเร็จในการเก็บโอโอไซต์โคนมผ่านทางช่องคลอดโดยไม่ใช้เครื่องอัลตราซาวด์ พบว่ามีความสะดวกในการใช้ง่ายและใช้เวลาเพียง 15 นาทีต่อตัว ในส่วนของกรมปศุสัตว์ โดยสำนักเทคโนโลยีชีวภาพการผลิตแศสัตว์ ได้ทดลองนำเทคนิคการปฏิสนธินอกร่างกายร่วมกับการเก็บเซลล์ไข่ผ่านทางช่องคลอดโดยไม่ใช้เครื่องอัลตราซาวด์ในโคพื้นเมือง (ณรงค์ และคณะ,2547) และสามารถผลิตตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสได้ (สุรจิต และคณะ,2547) โดยล่าสุดสามารถผลิตลูกโคพื้นเมืองได้ (มาลี และคณะ,2550)

 

เครื่องมือเก็บโอโอไซต์ผ่านผนังช่องคลอด

โดยไม่ใช้เครื่องอัลตราซาวด์

เครื่องมือเก็บโอโอไซต์ผ่านผนังช่องคลอด

โดยใช้เครื่องอัลตราซาวด์ 

 

ประโยชน์ของเทคนิคการปฏิสนธินอกร่างกาย

               ระยะเริ่มแรก จุดประสงค์หลักของการศึกษาวิจัย การปฏิสนธินอกร่างกายในโค ก็คือ เพื่อผลิตตัวอ่อนให้ถูกลง (Godon et al.,1994) เมื่อเทียบกับการผลิตตัวอ่อนโดยกระตุ้นเพิ่มการตกไข่ (Superovulation) และการเก็บตัวอ่อนโดยการชะจากปีกมดลูก (Embryo flushing/collection) ของสัตว์ ในการย้ายฝากตัวอ่อน (Embryo transfer : ET) เนื่องจากการปฏิสนธินอกร่างกาย สามารถเจาะเก็บเซลล์ไข่จากรังไข่จากรังไข่ที่ได้จากโรงฆ่าสัตว์ซึ่งจะได้เซลล์ไข่จำนวนมาก อันหมายถึงจะมีโอกาสผลิตตัวอ่อนได้จำนวนมากขึ้น ต่อมาได้มีการนำไปใช้ประโยชน์ในด้านอื่น ๆ เพิ่มมากขึ้น รวมทั้งนำไปประยุกต์ใช้ร่วมกับเทคนิคอื่น ๆ ทำให้การปฏิสนธินอกร่างกายหรือกระบวนการหรือส่วนของกระบวนการปฏิสนธินอกร่างกายเป็นเทคนิคพื้นฐานของเทคโนโลยีทางการสืบพันธุ์อื่น ๆ ได้แก่ การฉีดเซลล์ตัวอ่อนเข้าไปในไข่ (Intracytoplasmic sperm injection : ICSI) การฉีดยีน/ดีเอนเอ (Gena/DNA injection) การนำการปฏิสนธินอกร่างกายไปใช้ประโยชน์ด้านต่าง ๆ ได้แก่

 

               1.เพิ่มจำนวนตัวอ่อน/ลูกสัตว์ในราคาถูกลง

               2.ใช้ร่วมกับเทคนิคการเก็บเซลล์ไข่ผ่านทางผนังช่องคลอด (Ovum pick-up and in vitro embryo production : OPU-IVF) เพื่อผลิตตัวอ่อนอย่างไม่จำกัดจากแม่สัตว์พันธุ์ดีซึ่งสามารถผลิตตัวอ่อนเพื่อการค้าได้

               3.ใช้ทดสอบความสามารถการปฏิสนธิของเซลล์อสุจิ เป็นการตรวจสอบคุณภาพของน้ำเชื้อวิธีหนึ่ง

               4.ใช้แก้ปัญหาสัตว์ที่มีพันธุกรรมดี ให้ผลผลิตดี เช่น โคมีประวัติการให้ผลผลิตน้ำนมสูง แต่มีปัญหาผสมติดยาก อันเนื่องจากคอมดลูกคด หรือท่อนำไข่ตีบ หรืออายุมาก จนตั้งท้องเองไม่ได้ แต่รังไข่ยังทำงานได้ปกติ

               5.อนุรักษ์พันธุ์สัตว์ที่มีจำนวนจำกัด

 

กระบวนการผลิตตัวอ่อนโดยการปฏิสนธินอกร่างกาย

               กระบวนการผลิตตัวอ่อนจากการปฏิสนธินอกร่างกาย ประกอบด้วยขั้นตอนต่าง ๆ 7 ขั้นตอน ดังนี้

               1.การเก็บเซลล์ไข่จากรังไข่ ทำได้หลายวิธี เช่น การเจาะจากรังไข่โดยใช้เข็มฉีดยา ขนาด G 18-19 การผ่าฟอลลิเคิลบนผิวรังไข่ (dissect intact follicle) การใช้ใบมีดโกนกรีดบนผิวรังไข่ (slicing) และการเจาะเก็บผ่านทางผนังช่องคลอด (ovum pick-up : OPU) จากนั้นคัดเลือกเซลล์ไข่ที่มีคุณภาพดี

 

 

การเจาะเก็บไข่จากรังไข่ด้วยเข็มฉีดยา 

การผ่าฟอลลิเคิลบนผิวของรังไข่ 

 

                2.การเพาะเลี้ยงเซลล์ไข่ให้เจริญพร้อมปฏิสนธิในหลอดทดลอง (in vitro maturation) ใช้เวลา 20-24 ชั่วโมง มีปัจจัยที่มีผลต่อการเจริญพร้อมปฏิสนธิหลายประการ

 

 

ไข่ที่ยังไม่พร้อมปฏิสนธิ  cc : cumulus cell

ไข่ที่พร้อมปฏิสนธิ

 



ไข่ที่พร้อมปฏิสนธิหลังกำจัด cumulus cell ออก

(ลูกศร : 1st polar body)


               3.การเตรียมเซลล์อสุจิให้อยู่ในภาวะพร้อมที่จะปฏิสนธิ (capacitation of sperm) กับเซลล์ไข่ในหลอดทดลอง มีหลายวิธี ที่นิยมใช้อย่างแพร่หลายได้แก่ วิธี swim-up วิธี BSA/Percoll density gradients เป็นการคัดกรองเซลล์อสุจิเฉพาะที่แข็งแรงและสมบูรณ์

               4.การปฏิสนธิ (in vitro fertilization) เป็นการนำเซลล์ไข่ที่เจริญพร้อมปฏิสนธิมาเลี้ยงร่วมกันกับเซลล์อสุจิที่เตรียมไว้ในข้อ 3.ระยะเวลาในการเลี้ยงร่วมกันตั้งแต่ 6-18 ชั่วโมง ขึ้นกับชนิดน้ำยาปฏิสนธิและจำนวนเซลล์อสุจิ หลังจากเซลล์ไข่ปฏิสนธิกับเซลล์อสุจิแล้วประมาณ 1 วัน จะเรียกว่า Zygote ซึ่งก็คือ ตัวอ่อนอายุ 1 วัน เมื่อสังเกตดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ชนิด DIC (Differential interference contrast) จะสามารถมองเห็นโปรนิวเคลียสของตัวอ่อนได้อย่างชัดเจน

              

               5.การเพาะเลี้ยงตัวอ่อนหลังปฏิสนธินอกร่างกาย (embryo culture) ในโคจะเลี้ยงตัวอ่อนถึงระยะมอรูล่าหรือบลาสโตซีส โดยใช้เวลา 6-7 วัน จึงนำไปฝากในมดลูกของโคตัวรับ สำหรับระบบการเพาะเลี้ยงตัวอ่อน มี 2 ระบบ คือ เลี้ยงภายในร่างกายสัตว์ (in vivo culture) หมายถึงเลี้ยงในท่อนำไข่หรือในไข่ไก่และในหลอดทดลอง (in vitro culture) ในปัจจุบันนิยมใช้ในการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง โดยมีการใช้น้ำยาเลี้ยงชนิดต่าง ๆ และระบบการเลี้ยงที่มีหรือไม่มีเซลล์ร่วม (co-culture system)

               6.การเก็บรักษาตัวอ่อน ส่วนใหญ่จะใช้วิธีแช่แข็ง เพื่อเก็บไว้ในรูปตัวอ่อนแช่แข็ง การแช่แข็งตัวอ่อนแช่แข็ง ทำได้หลายวิธี ได้แก่ การแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิลงช้า ๆ ส่วนใหญ่จะใช้เครื่องแช่แข็งแบบมีโปรแกรมการลดอุณหภูมิแบบอัตโนมัติ การแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิลงอย่างรวดเร็วโดยใช้หรือไม่ใช้เครื่องแช่แข็ง

               7.การฝากตัวอ่อนไปยังตัวรับ เมื่อตัวอ่อนเจริญถึงระยะมอรูล่าหรือบลาสโตซีส หากมีตัวรับพร้อม คือหลังเป็นสัดยืนนิ่ง 7 วัน ก็สามารถนำตัวอ่อนไปฝากแบบตัวอ่อนสดได้หรือตัวอ่อนแช่แข็ง

 ขั้นตอนของกระบวนการผลิตตัวอ่อนจากการปฏิสนธินอกร่างกายโค

 

วิธีตรวจสอบการปฏิสนธิ

               การตรวจสอบการปฏิสนธิ เป็นการตรวจว่ามีเซลล์อสุจิสามารถเจาะผ่านเข้าไปในไข่ได้หรือไม่ตลอดจนตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงลักษณะของนิวเคลียสของทั้งไข่และอสุจิ การปฏิบัติงานด้านการปฏิสนธินอกร่างกาย จำเป็นต้องมีการตรวจสอบการปฏิสนธิเพื่อทดสอบประสิทธิภาพของวิธีการที่ใช้ในการดำเนินงานการตรวจสอบมีหลายวิธี ได้แก่

               1.วิธีย้อมสี เพื่อตรวจสอบการเกิดโปรนิวเคลียสของเซลล์อสุจิและเซลล์ไข่ภายใน cytoplasm การย้อมสีสามารถดำเนินการได้หลังการนำเซลล์อสุจิผสมกับเซลล์ไข่ 18-19 ชั่วโมง ส่วนวิธีย้อมสีมีหลายวิธี ได้แก่ การย้อมแบบ rapid staining method (Byun et al.,1991) การย้อมด้วย aceto-orcein ก็เป็นวิธีหนึ่งที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลาย ทั้งสองวิธีใช้ค่าใช้จ่ายไม่แพง อีกวิธีหนึ่งคือ การย้อมด้วยสีที่เป็น DNA probe ได้แก่ propidium iodine (PI),DAPI,Hoechst 33258 โดยต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ที่ติดอุปกรณ์ฟลูออเรสเซนส์

               2.ตรวจสอบอัตราการแบ่งตัวของตัวอ่อน การตรวจการแบ่งตัวของตัวอ่อนที่ระยะ 2-4 เซลล์ สามารถตรวจสอบได้หลังจากการเลี้ยงตัวอ่อน 42 ชั่วโมง หลังการผสมกับอสุจิ (Gordon,1994) วิธีนี้ไม่ทำให้ตัวอ่อนตายเหมือนวิธีแรก ทำให้ไม่สูญเสียตัวอ่อน อย่างไรก็ตามไม่สามารถตรวจสอบรายละเอียดการปฏิสนธิได้

               3.ตรวจสอบจำนวนเซลล์อสุจิที่ติดในเปลือก (zona pellucida) ของเซลล์ไข่ โดยอาศัยหลัการ หลังจากเซลล์อสุจิตัวแรกสามารถเจาะผ่านเข้าไปเปลือกแล้ว จะเกิด "zona reaction" เพื่อไม่ให้ตัวอสุจิตัวอื่น ๆ เข้าไปได้ ดังนั้นเซลล์อสุจิที่เหลือจะติดอยู่ที่เปลือก สามารถสังเกตได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์

               4.การตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีการทำงานแบบ DIC วิธีนี้ใช้ได้ในกรณีเซลล์ไข่ชนิดที่มีไขมันภายใน cytoplasm น้อย เช่น ไข่ของกระต่าย หนู คน

โปรนิวเคลียสของไข่และอสุจิของคน ที่สังเกตได้จากกล้อง DIC

 

ปัจจัยที่มีผลต่อความสำเร็จในการปฏิสนธินอกร่างกาย

               แม้ว่าจะมีการศึกษาการปฏิสนธินอกร่างกายมามากกว่า 40 ปี และมีรายงานความสำเร็จจากหลายห้องปฏิบัติการ แต่ก็ยังมีอีกหลายแห่งที่มีอัตราความสำเร็จต่ำ หรือไม่สามารถผลิตตัวอ่อนได้ แม้ว่าจะใช้วิธีการเดียวกับรายงานของต่างประเทศก็ตาม ทั้งนี้เนื่องจากขั้นตอนการปฏิบัติงานปฏิสนธินอกร่างกาย ประกอบด้วยหลายขั้นตอน ซึ่งต้องอาศัยความละเอียดอ่อน ระมัดระวังในทุกขั้นตอน อีกทั้งยังต้องคำนึงถึงหลักวิชาการ Godon(1994) ได้รวบรวมปัจจัยต่าง ๆ ที่มีผลต่อความสำเร็จในการดำเนินงานปฏิสนธินอกร่างกาย สรุปได้ดังนี้

               1.คุณภาพของเซลล์ไข่ เซลล์ไข่ที่มีคุณภาพดี ที่ถูกคัดเลือกเข้ากระบวนการปฏิสนธินอกร่างกาย จะให้อัตราการเจริญของตัวอ่อนถึงระยะบลาสโตซีสมากกว่าเซลล์ไข่ที่มีคุณภาพด้อยกว่า เซลล์ไข่ที่มีคุณภาพดี คือเซลล์ไข่ที่มีชั้นของเซลล์คิวมูลัสเกาะติดกันอย่างแน่นหลายชั้น (compact multilayered cumulus) ไซโตรพลาสซึมและเซลล์คิวมูลัสมีสีนวลสม่ำเสมอ

เซลล์ไข่คุณภาพดี มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มหลายชั้น

 

               2.ระบบเพาะเลี้ยงเซลล์ไข่ให้เจริญพร้อมปฏิสนธิในหลอดทดลอง รวมถึงชนิดของน้ำยาเพาะเลี้ยง ส่วนประกอบของสารเคมี ฮอร์โมน ชนิดและขนาดของสารที่เติม อุณหภูมิ ระยะเวลา ตลอดจนสภาวะบรรยากาศในตู้เพาะเลี้ยง

               3.คุณภาพของน้ำเชื้อแช่แข็งที่ใช้ในการปฏิสนธิ ต้องเป็นน้ำเชื้อที่มีคุณภาพหลังละลายตามมาตรฐานของน้ำเชื้อแข็งที่สามารถนำไปผสมเทียมแบบปกติได้

            4.วิธีการเตรียมน้ำเชื้อก่อนนำไปปฏิสนธิกับเซลล์ไข่ การเตรียมน้ำเชื้อมีหลายวิธีได้แก่ swim-up technique, Glass-wool filtration, BSA/Percoll density gradients  รวมถึงความเข้มข้นของตัวอสุจิและปริมาณของน้ำยาที่มีตัวอสุจิ ที่จะนำไปผสมกับน้ำยาที่ใช้ปฏิสนธิ ซึ่งมีผลต่ออัตราการปฏิสนธิ โดยแต่ละห้องปฏิบัติการควรมีการตรวจสอบว่า วิธีการใดเหมาะกับชนิดของน้ำเชื้อดีที่สุด ให้ผลการปฏิสนธิดีที่สูงสุด และให้ผลอัตราการเจริญของตัวอ่อนไปถึงระยะบลาสโตซีสดีที่สุด

               5.ระบบการเลี้ยงในช่วงปฏิสนธิ หมายถึงการเลี้ยงเซลล์ไข่ที่พร้อมปฏิสนธิร่วมกับตัวอสุจิ มีทั้งแบบเลี้ยงใน microdrop เลี้ยงในหลุมของถาดพลาสติก การเลี้ยงร่วมกับเซลล์อื่น ๆ อุณหภูมิ ระยะเวลาการเลี้ยง สภาพแวดล้อมในตู้เพาะเลี้ยง รวมถึงน้ำยาที่ใช้ในการปฏิสนธิ

               6.ระบบการเพาะเลี้ยงตัวอ่อนหลังการปฏิสนธิ การเลี้ยงตัวอ่อนในท่อนำไข่ เป็นที่นิยมใช้ในช่วงเวลาที่เริ่มมีการศึกษาการปฏิสนธิ โดยท่อนำไข่ที่ได้มากจาก กระต่าย แกะ โค โดยการมีท่อนำไข่ต่างชนิดกับตัวอ่อน เช่น ใช้ท่อนำไข่แกะมาเลี้ยงตัวอ่อนโค ซึ่งพบว่าได้ผลดี อย่างไรก็ตามวิธีนี้ไม่สะดวกนัก จึงมีการศึกษาการเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองโดยมีเซลล์พี่เลี้ยง หรือเลี้ยงร่วมกับเซลล์ชนิดต่าง ๆ ต่อมามีการศึกษาการใช้น้ำยาเลี้ยงชนิดที่ไม่ต้องมีเซลล์พี่เลี้ยง ระบบการเพาะเลี้ยงมีผลอย่างมากต่ออัตราการเจริญของตัวอ่อนไปถึงระยะบลาสโตซีส ตลอดจนการเจริญของ fetus ในท้องแม่

 

สรุป

               การดำเนินงานด้านการปฏิสนธินอกร่างกาย ต้องคำนึงถึงปัจจัยต่าง ๆ ที่มีผลต่อความสำเร็จและต้องปรับปรุงให้ทันสมัยตลอดเวลา เทคนิคการปฏิสนธินอกร่างกาย ได้ถูกพัฒนามาจนสามารถนำมาใช้ผลิตลูกสัตว์ได้อย่างกว้างขวางในต่างประเทศและในประเทศไทยก็สามารถนำมาใช้อย่างได้ผลแล้ว แต่ยังไม่กว้างขวางมากนัก หากมีการนำมาใช้อย่างจริงจังมากขึ้นทั้งรัฐและเอกชน จะทำให้การพัฒนาการปรับปรุงพันธุ์ รวมถึงการเพิ่มจำนวนสัตว์พันธุ์ดีไปได้อย่างรวดเร็วยิ่งขึ้น